グリアアセンブリによる脳機能発現の制御と病態

生後早期に神経回路は急激に成熟し、ある種の学習や経験依存的な脳機能はこの時期(臨界期)にしか獲得することができません。臨界期は脳の様々な領域で異なった時間的な「窓」を持っており、臨界期の開始と終結は神経回路の再編成が許される時期と不可能となった時期に対応しています。神経回路の再編成において最も重要な過程はシナプス結合のリモデリングですが、イメージングの進歩によって、グリアがシナプスの形成と除去にきわめて重要な役割を持つことが明らかになってきています。

これまでの研究でアストログリアはシナプスの維持を助け(Nishida & Okabe J. Neurosci. 2007)、ミクログリアはシナプスの除去を制御している(Wake et al, J. Neurosci. 2009; Kondo & Okabe Mol. Brain 2011)のではないかと考えられています。更に臨界期は、まさに脳内で各種のグリア細胞がその数を増やし、分化し、機能発現を行う時期に対応しています。
そこで本研究では　大脳皮質で生後早期に分化・成熟するグリアアセンブリによるシナプスリモデリングの制御が神経回路の経験依存的な変化と脳の臨界期のタイミングに決定的な役割を果たしているという作業仮説を検証します。

具体的には以下の三つの疑問に段階的に答えようと考えています。
（１）生後早期の臨界期の脳内でアストログリアとミクログリアがシナプスとどのような形態的・空間的な相互作用をしているのか。
（２）グリア機能を操作した際に、シナプスのリモデリングにどのような影響が現れるのか。
（３）シナプス・グリア相互作用を制御する分子機構の実体は何か。
これら形態・機能・分子の三つの所見を総合して、シナプスリモデリング―グリア発達―臨界期の間の関係性を示すことが最終的な目標です。

本研究では、A02岡部班「グリアアセンブリによるシナプスリモデリングの制御機構」のプロジェクトの一環として、主に小脳の神経回路をモデル実験系として用い、生後発達期のシナプスの刈り込みにおけるグリアアセンブリの機能的な意義について解析を行います。

脳の神経細胞は軸索を伸ばして他の神経細胞にシナプスを形成し、複雑な神経回路を形成しています。神経回路が機能的であるためには、シナプスが適切な標的細胞に適切な強度で形成されることが必要不可欠ですが、生まれたばかりの動物の脳には大人の動物に比べて過剰なシナプスが形成されており、機能的にも未成熟な状態にあります。その後の生後発達過程において必要な神経シナプスが残存・強化され、不必要なシナプスが弱化・除去されることにより、次第に機能的な神経回路が形成されます（シナプスの刈り込み）。シナプスの刈り込みは生後発達期の特定の時期（臨界期）に起こり、健やかな脳機能成熟の礎と考えられています。

本研究では主に固定組織や生体組織のイメージング法と電気生理学的手法を駆使して、シナプス刈り込みが進行している生後発達期の脳における、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなどの機能、分布、形態などの解析をおこないます。この解析と、これまでに解析が進んでいる小脳神経回路の時間的・空間的生後発達変化のデータを比較・検討し、生後発達過程における神経とグリアの相互作用やその機能的意義、関与する分子機構について明らかにしたいと考えています。

中枢神経系の情報伝達はシナプスで行われます。生後まもない幼若脳においては、シナプスはニューロンの突起の伸長にあわせ形成され、その数は一時的に増加し、その後、神経活動依存的なシナプスの成熟にともない、必要なシナプスだけが残されるいわゆる“シナプスの刈り込み”（プルーニング）がおこり、ニューロンネットワークが成熟型へと発達します。この幼若脳から成熟脳に至るシナプスの形成・成熟の過程について、その分子基盤は明らかにされていません。そこで本研究では、形態的に明確な臨界期が観察される小型霊長類であるマーモセットおよび分子生物学的実験技法が確立されているマウスを用いて、神経回路成熟の分子基盤の解明を目指します。

具体的にはマウスおよび小型霊長類であるマーモセットについて、発達過程の種々の脳領域における組織のサンプリングを行い、当研究所で開発したマーモセットのDNAチップならびに既存のマウスのDNAチップを用いて遺伝子発現プロファイルを作製し、機能的神経回路形成の分子群を検討します。両者の比較検討による遺伝子プロファイルのバリデーションは、ミクログリアに着目しミクログリア機能に関わる分子群を候補分子とします。
さらに、ニューロン・ミクログリアの機能相関に基づき、シナプスの形成・維持・成熟に関わる分子群も候補分子とします。これらの候補分子の機能解析は、遺伝子発現やRNAiによる発現抑制などマウスにおける分子生物学的な実験技法を用いるとともに、マーモセットを用いた機能解析も行う予定で、一方、ニューロン・ミクログリアの機能形態学的解析として、電子顕微鏡を用いた超微細構造解析、およびミクログリア可視化マウスであるIba1-EGFPトランスジェニックマウスにおける二光子レーザー顕微鏡を用いた動態解析を行います。

オリゴデンドロサイトは、ニューロンの軸索の周囲にミエリンを形成する細胞です。その前駆細胞はシナプス入力を受ける事が知られており脳内情報伝達に関わることが示唆されています。我々は、オリゴデンドロサイトの発生・分化に必須のOlig転写因子を同定し、その機能解析を行ってきました。また、薬剤投与によりオリゴデンドロサイト前駆細胞で時期特異的にDNA組換えを起こす細胞系譜追跡実験系を開発し、成体脳の白質においてオリゴデンドロサイト前駆細胞からミエリン化オリゴデンドロサイトへの最終分化が継続して起こっていることを示しました。この現象の生理的意義や分子メカニズムは明らかになっていません。一方、ヒト大脳皮質においてミエリン化が完成する時期は各領域で異なっており臨界期との関わりが示唆されています。
以上の背景をもとに、本研究では、オリゴデンドロサイト前駆細胞の発達期および成体期における脳内動態を詳細に明らかにするとともに、オリゴデンドロサイトと神経回路の機能的な相互作用を明らかにしていきます。

１）オリゴデンドロサイト前駆細胞の脳組織内動態の詳細な形態解析
２）発達期のオリゴデンドロサイト前駆細胞の数の変化や最終分化が神経回路の再構成ならびに臨界期に及ぼす影響
３）成体脳におけるオリゴデンドロサイト新生の生理学的意義

新学術領域の各研究班と連携をしながら、オリゴデンドロサイト分化制御分子の解析を行うととともに、遺伝子改変マウスや薬剤投与などの方法を用いて、オリゴデンドロサイト前駆細胞の数を増減する実験系を確立し、神経回路の再構成ならびに臨界期に及ぼす影響を調べます。以上の実験により、グリアアセンブリにおけるオリゴデンドロサイトの役割を明らかにできるだけでなく、これまでほとんど研究の進んでいなかった発達過程のヒト疾患（運動・精神発達遅滞や脳室白質軟化症など）の病態解明とその治療法開発の橋渡し研究となることが期待されます。

本研究では、脳発達過程における神経回路・グリア相関のダイナミズムの分子的基礎、並びに、グリアアセンブリ障害による、その相関の破綻が、自閉症スペクトラム等の精神神経疾患の病態生理に与る仕組みを、主に脳機能イメージング等によるin vivo脳内分子動態解析技術を適用しながら探究することを目的とします。これまでに私たちは、ポジトロン断層法(PET)によって自閉症スペクトラム患者脳で病態特異的なミクログリアの活性化を確認しました(Suzuki K et al., JAMA Psychiatry, 2013)。活性化ミクログリアの集積は、罹患脳の紡錘状回、前帯状皮質、眼窩前頭皮質等で著明です。
また、私たちは最近、核磁気共鳴画像法(MRI)を用い統合失調症患者にて髄鞘を画像化することで、視床と眼窩前頭皮質を結ぶ白質神経線維の変性、及び、その線維連絡の脆弱化と相関する結合大脳皮質の萎縮を見出しました(Kubota M et al., JAMA Psychiatry, 2013)。

そこで、本研究では、まず、9.4T超高磁場機器によるMRI、及びPET等のin vivo脳解析技術を駆使し、脳発達期のヒトと自閉症スペクトラム等の精神神経疾患患者にて神経回路発達に与るニューロン・グリア相関の形態学的並びに機能解析を行います。即ち、ここでは高磁場MRI機器による高解像度での脳の形態学的解析と併せ、13C,17O、23Na等のプロトン以外の安定同位体含有物質のMRI、高精度トラクトグラフィ等を、健常人と脳発達障害患者で実施し、脳発達過程における脳内代謝動態及び神経線維・髄鞘相関ダイナミズム、病態脳での神経回路病変等を描出します。
また小児でのfMRI脳機能画像取得を、独自のMRIステルス技術を適用し行う他、[11C]PK11195と[18F]FDGにより、PETで自閉症スペクトラム等の病態脳における神経回路障害と脳内ミクログリア動態の相関を解析します。
これらによって本研究では、脳発達臨界期における神経回路の機能的成熟にグリアアセンブリが働く仕組み、並びに、ニューロン・グリア相関の不可逆的破綻が成長後種々の精神神経疾患を惹起する機序を、健常人と患者で探究します。

近年、脳発達臨界期の神経回路の機能的成熟にグ リアアセンブリが主体的に働き、その機能障害によるニューロン・グリア相関ダイナミズムの不可逆的変容が、青壮年期における自閉症スペクトラム、統合失調症等の精神神経疾患発症に働くことが強く示唆されています。しかし、旧来の研究では臨界期にリアルタイムで神経回路の機能的成熟に掛かるグリア活動のダイナミズムを解析することが叶わず、そのためのin vivo脳機能画像法やグリア機能プロービング技術等の創出が俟たれていました。

そこで、本研究では、齧歯類とマカクザル等の高等霊長類にて、脳発達過程における神経回路の機能的成熟にミクログリアやオリゴデンドロサイト等のグリアが働く仕組みを、PET、MRI、蛍光画像法等のin vivo分子イメージング技術によりリアルタイムで解析します。また、相関破綻とグリアアセンブリ障害が成長後の脳機能及び精神症状の発露に及ぼす影響を、脳機能イメージング、行動学的解析等により評価します

さらに、本研究では、ヒトと動物で脳発達臨界期における神経回路の機能的成熟に与るグリアアセンブリ機能分子を分子標的とするPETトレーサー、MRIプローブ、蛍光指示薬等を創製することをねらいとしています。そして、当該標的分子の病的挙動と、成長後に来す自閉症スペクトラム等の脳発達障害との関連付けを行います。ここでは、また、臨界期の神経回路・グリア相関の破綻を修復するための医薬候補化合物の探索を、グリアアセンブリ機能分子を治療標的として行い、脳発達障害創薬への応用を図ります。