これまでの成果と今後の展望

B.　これまでの成果と今後の展望

1. 背景

(ア) AMPA受容体（グルタミン酸受容体サブタイプ

① グルタミン酸受容体はイオンチャネル型と代謝調節型がある。AMPA受容体はNMDA受容体、カイニン酸受容体などと共に前者に属す。

② AMPA受容体は速い神経伝達を制御する神経細胞の興奮性を規定するグルタミン酸受容体で、中枢神経に広く分布している。

③ AMPA受容体は4種類のサブユニット（GluA1～ GluA4）の様々な組み合わせに依る四量体構造をとり、Na⁺/ K⁺を透過させることで、膜電位を制御している。
(図2)

④ サブユニット構成によりCa²⁺ 透過性のものと非透過性のものがある(図2)。 Ca²⁺非透過性AMPA受容体が圧倒的大多数を占める。Ca²⁺ 透過性AMPA受容体の過剰発現は動物にてんかんを引き起こすことが知られていた。

(イ) GluA2サブユニットとそのRNA編集(RNA editing) (図2)

① AMPA受容体と Ca²⁺ 透過性

1. AMPA受容体のCa²⁺透過性はGluA2がサブユニットに含まれるかどうかで決まる。正常のニューロンが発現するGluA2は全て編集型（②で後述）である。

2. Ca²⁺非透過性AMPA受容体：ニューロンに発現するAMPA受容体の大多数を占め、編集型GluA2 をサブユニットに含む

3. Ca²⁺透過性AMPA受容体：サブユニット構成にGluA2を欠くもの（生理的には海馬の抑制性ニューロンやグリア細胞）と、未編集型GluA2を含むもの（生理的にはグリア細胞の一部に存在するとされる）とがある。

② 未編集型GluA2の発現の意味するもの

1. GluA2はグルタミン・アルギニン部位（Q/R部位）でRNA編集[1]を受ける。

2. すなわち、GluA2 pre-mRNAエクソン11にあるグルタミン（Q）コドン（CAG）のアデノシンがイノシンに置換され、翻訳時にイノシンはグアノシンとして認識されるので、アルギニン（R）（CGG = CIG）に翻訳される。ゲノム情報CAGがタンパクレベルではR (CGG)に置換される。

3. Q/R部位はチャネルに面しており、陽荷電のRはCa²⁺ の透過をブロックするが、中性のQはブロック出来ない。

4. AMPA受容体の他の３種類のサブタイプのQ/R部位にはRNA編集が起こらず、Q型のため、GluA2をサブユニットに持たないAMPA受容体やGluA2がサブユニットに含まれていても未編集の場合、AMPA受容体のCa²⁺ 透過性は高い。

5. ヒトを含む哺乳類ではGluA2のQ/R部位は100％編集され、GluA2の発現もAMPA受容体サブユニットの過半を占めるため、ニューロンに発現するAMPA受容体は殆どがCa²⁺非透過性である。

6. GluA2Q/R 部位にRNA編集が起こらないことで

a）AMPA受容体のチャネル特性が変わる（Ca2+透過性になる）

b）未編集型GluA2は編集型GluA2に優先してシナプス後膜へ輸送される

c）そのため、未編集型GluA2が発現した分、機能的AMPA受容体に占めるCa2+透過性AMPA受容体の割合が増す。（ニューロンへのCa2+流入は未編集型GluA2が100％になると野生型の29倍、50％でも4〜5倍とされている。⁷

d）GluA2のRNA編集が出来ない変異動物はてんかん重積のため、生後3週以内に死亡してしまう。^8,9

7. したがって、未編集型GluA2の発現自体が少量であっても異常である。

(ウ）RNA編集酵素ADAR2 (adenosine deaminase acting on RNA 2)
(図3)

① 哺乳類の中枢神経ではRNA編集が極めて盛んに行われている。その大多数はアデノシン・イノシン（A-I）置換である。

② このA-I置換は二重鎖RNAに働く酵素により行われ、哺乳類では3種類のアイソフォーム（ADAR1-ADAR3）が知られている。

③ GluA2 Q/R部位のA-I置換は特異的にADAR2により触媒され、ADAR2の欠損ではこの部位のRNA編集は起こらない。

④ ヒトでの検討でADAR1，ADAR2とも中枢神経では主にニューロンに発現し、A-I置換に関與しているが、ADAR3は中枢神経特異的な発現パターンを持ちながら､発現は主としてグリアで、A-I置換活性も明らかでない。¹⁰

2. 孤発性ALSに働いている疾患特異的分子異常について

(ア) 孤発性ALSでは、運動ニューロン選択的に、未編集型GluA2が発現している^11,12。
(図4))

① 単一運動ニューロンに発現する未編集型GluA2の発現割合は、GluA2 mRNA全体の0％～100％⁶と大きくばらつく。¹¹

② GluA2 mRNAの発現は低下していない¹⁴。

③ 運動ニューロンに未編集型GluA2が発現しているALS症例でも、小脳のプルキンエ細胞では発現していない(部位選択的) ¹¹。

④ 30例以上の孤発例全例で未編集型GluA2を発現する運動ニューロンがみられる（汎発性）¹⁴。

⑤ 他の運動ニューロン疾患　SODI関連ALS(ALS１)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA）を含む疾患対照、健常対照の運動ニューロンは、すべて編集型GluA2のみを発現している
（疾患特異性）^11,12,15。

(イ) 孤発性ALSの運動ニューロンではADAR2の発現低下に依るA-I置換活性が低下している。
(図5)

① ADAR2 mRNAの発現レベルの低下、ADAR2特異的RNA編集部位における未編集型mRNAの割合の増加^2,14。

② ADAR1、ADAR3 mRNA発現量、ADAR1特異的編集部位のRNA編集活性には変化がない¹⁴。

③ 未編集型GluA2を発現する孤発性ALS運動ニューロンのADAR2 mRNA発現レベル低下は著しいが（正常対照の1/100）、編集型GluA2のみを発現する運動ニューロンでも既に低下している（正常対照の2/3～1/2）¹⁴。

(ウ) 以上は我々が見出した異常だが、RNA編集異常の発見の後、TDP-43病理（後述）も疾患特異性の高い病態であることが日米の研究グループから独立に報告された。^16,17

3. ADAR2低下に依る未編集型GluA2発現の意味：分子病態モデルマウス（コンディショナルADAR2ノックアウトマウス；ADAR2^flox/flox/VChAT-Cre.Fast; AR2マウス）を開発し、運動ニューロン死の原因かどうかを解析を用いた解析（図6 ）

(ア) 運動ニューロン死の原因であることの証明

① ADAR2缺損マウスはけいれん重積のため生後三週以内に死亡してしまう。運動ニューロン死が起こるかどうかは不明だった。

② そのため、運動ニューロン選択的にADAR2を欠損させたコンディショナルADAR2ノックアウトマウス（AR2）を作成¹⁸。
(図6A)

③ AR2マウスでは ¹⁸

1. 進行性の運動機能低下がみられる（図6A）。

2. 約半数の運動ニューロンではADAR2がCre依存性にノックアウトされ、その運動ニューロンではGluA2のRNA編集が起こらない(図6A)

3. ADAR2を缺損した運動ニューロンはすべて細胞死に陥る。変性の速度は25％〜50％/月程度で、残存するADAR2を缺損した運動ニューロン数はF(t)=A(1/2)^bt（t：時間、A,b：係数）に近似する。神経変性疾患に特有な「緩徐進行性の神経細胞死」を引き起こす。
(図6B)

④ 運動ニューロンの変性は、遺伝子に編集型GluA2を組み込んだ変異マウスとの掛け合わせにより阻止される。
(図6D)
このマウスはADAR2の缺損した運動ニューロンでも編集型GluA2を発現するので、ADAR2の発現低下そのものではなく、未編集型GluA2発現が細胞死に直結する分子異常であることを示している¹⁸。

(イ) ALS相同の運動ニューロンにおける細胞死の選択性

① ALS同様、外眼筋ニューロンには未編集型GluA2が発現しているにもかかわらず脱落が見られない¹⁸。
(図6C)。

② 外眼筋ニューロンが細胞内Ca2+濃度上昇に抵抗性である理由としての仮説。

1. 細胞内Ca²⁺バッファータンパクの発現が運動ニューロンより遙かに高い

2. 豊富な抑制性（GABA作動性）ニューロンの入力がある

(ウ) 運動ニューロンの生存にとり必要なADAR2 発現レベルは正常の50％以上

① ADAR2発現低下と未編集型GluA2発現

1. (ア)−④に記載したように編集型GluA2の発現自体が運動ニューロンにとり有害なので、全てのGluA2のQ/R 部位を編集するのに必要なレベルのADAR2 発現が必要である。

2. ヘテロ接合体AR2マウスADAR2⁺/flox/VChAT-Cre.Fast； AR2H）では、運動ニューロンの2割が未編集型GluA2を発現し、同数の運動ニューロンが脱落する。AR2HではADAR2アリルの片方の発現は保たれ、約50％のADAR2活性と考えられるので、ADAR2発現の半減はALS発症の危険水域といえる。¹⁹。(図7)

3. ALS患者の剖検脊髄から切り出した単一運動ニューロン組織の解析から、編集型GluA2のみを発現している運動ニューロンではADAR2 mRNAの発現レベル低下は正常対照の2/3〜1/2程度（すなわちADAR2 活性が50％以下になると未編集型GluA2 が発現する）

② 未編集型GluA2発現とカルシウム透過性AMPA受容体発現

1. １−（イ）−②に記載したように、Ca2+を過剰に透過するAMPA受容体が発現する。そのため、運動ニューロン内のCa2+濃度が異常に上昇する。

③ このような研究結果から、ALSの病因にはADAR2発現低下に依る未編集型GluA2の発現が大きな役割を果たしているという仮説を提唱している¹⁹。
(図7)

4. ALSの特異マーカーとの関連

(ア) TDP-43病理：ALS患者脊髄運動ニューロンにみられる神経病理学的指標

① TDP-43病理：本来は核に局在するRNA結合タンパクであるTDP-43が、ALSの運動ニューロンでは核から喪失し、細胞質に異常な封入体が形成されている。しかも、TDP-43は異常な断片化、リン酸化を受けている。

② 大多数の孤発性ALS、一部の遺伝性ALS患者で運動ニューロンにTDP-43病理が観察されることから、ALSの神経病理学的指標となっている。

③ 孤発性ALS運動ニューロンでは、TDP-43陽性封入体の出現とADAR2の免疫活性消失とが同一の運動ニューロンに生じており、TDP-43陽性封入体を持たない
運動ニューロンではADAR2免疫活性が保たれている20。
（図8）

④ すなわちTDP-43病理が出現メカニズムとADAR2が低下するメカニズムの間には何らかの連関がある²⁰。

(イ) 分子病態モデルマウス（AR2マウス）における所見

① ADAR2低下とTDP-43病理の分子連関の検討を行い、ADAR2活性低下がTDP-43病理を引き起こすことを明らかにした。

1. 培養細胞での検討からTDP-43の断片化、過剰発現、ノックダウンによる減少、変異TDP-43の発現は何れも培養細胞のADAR2 発現低下を引き起こさない²¹

2. 分子病態モデルマウス（AR2マウス）のADAR2 を欠損した運動ニューロンでTDP-43病理類似の細胞内局在異常が観察される²²

3. そのメカニズムは、AMPA受容体から流入した過剰なカルシウムがタンパク分解酵素であるカルパインを活性化し、TDP-43を凝集しやすい断片に切断することであることを証明した²²

② カルパイン断片に相同の断片がALS患者剖検脳・脊髄にも検出された²² ことは、ALSの運動ニューロンでも同様のメカニズムによりADAR2 活性低下がTDP-43病理を引き起こしている可能性を示唆する。
（図9）

(ウ) ADAR2 活性低下に依りTDP-43病理が形成されるメカニズム
ADAR2 発現低下 → Q/R 部位未編集型GluA2の発現→Ca2+透過性AMPA受容体の発現 → 細胞内Ca2+濃度の上昇 → Ca2+依存性プロテアーゼであるカルパインの活性化 → TDP-43の断片化→断片の凝集性昂進による凝集塊・封入体形成 → 核と細胞質をシャトルするTDP-43の封入体への巻き込み → 核からのTDP-43の喪失。
（図10左）

(エ) 孤発性ALS以外のTDP-43病理

① 一部の遺伝性ALSの運動ニューロンにもTDP-43病理が観察される。

1. TARDBP(TDP-43をコードする遺伝子)関連ALS

2. C90RF72関連ALS

② 大脳皮質や海馬ニューロンなどにTDP-43病理が観察される

1. 前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病、拳闘家脳症など

2. 正常高齢者

(オ) TDP-43病理の形成にはカルパインが中心的に関與していることが明らかになったので、これら孤発性ALSのTDP-43病理形成にどのようにカルパインが関わるかが今後の検討の対象になる。

① カルパインの活性化は細胞内Ca²⁺濃度の上昇によるので、複数の細胞内Ca²⁺濃度を高めるシステムのどれが働くかにより、異なったメカニズムでカルパインが活性化しうる。

1. NMDA受容体、Ca²⁺チャネルなど細胞外からの流入

2. ミトコンドリアや小胞体など細胞内のCa2+貯蔵庫からの放出

② カルパイン活性が高すぎると、易凝集性TDP-43断片はより小さい可溶性の断片に切断される。

1. TDP-43病理の形成には、ほどよいカルパインの活性が持続する細胞内環境が必要

2. 脳虚血や脳外傷ではNMDA受容体などからの大量のCa2+流入があり、しかも一過性なので、TDP-43の局在異常が一過性であり、封入体形成を伴わない ²²
(図11)

3. TDP-43のリン酸化はカルパインによる切断活性への抵抗性を増強する²³

(カ) カルパインの活性化以外に、TDP-43のカルパインへの脆弱性が増すことによっても､易凝集性断片が生じうる。

① TARDBP（TDP-43をコードする遺伝子）に変異のあるALSは、変異TDP-43がカルパインに切れやすくなることにより起こる。

② 運動ニューロンにはAMPA受容体のカルシウム透過性を決定するGluA2の発現が他のニューロンに比べ低いため、GluA2をサブユニットにもたないAMPA受容体、すなわちCa2+透過性AMPA受容体の発現が多く、活性型カルパインの発現も多いことがTARDBPの変異がALSとして現れる理由であろう²²
(図10右)、図12